ライブラリの定量化のための一般的な方法と手法

ハイスループットシーケンス（NGS）を探索する広大な分野では、ライブラリの定量化は、シーケンスデータの品質と深さを確保する上で重要なリンクとして重要な役割を果たします。このステップは、実験の成功だけでなく、その後のバイオインフォマティクス分析の精度と信頼性にも直接影響します。テクノロジーの継続的な進歩により、ライブラリの定量化の方法はますます多様化しており、さまざまな実験シナリオとニーズに適しています。

ライブラリの定量化

1.ライブラリの定量化の重要性1.シーケンスデータの品質を確認する：ライブラリの定量化により、シーケンサーにロードされたDNAライブラリの量が中程度であることを保証し、それにより、ライブラリ濃度が過剰になっているか、過度のライブラリ濃度によるシーケンスデータが不十分であるため、シーケンスデータが不十分であることを保証します。 2。各サンプルデータの出力を安定させる：複数のライブラリが結合されてシーケンスされた場合、ライブラリの定量化は、シーケンスデータボリュームの要件に従って、各サンプルデータボリュームの出力を安定させるために、対応するモル量のライブラリを混合するのに役立ちます。

2。一般的な方法1。UV分光光度測定（1）原理：核酸（DNAおよびRNAを含む）の塩基には芳香環構造が含まれているため、紫外線吸収の特性があります。核酸の紫外線吸収ピークは260 nmであると同時に、核酸の純度はA260/A280およびA260/A230の値を計算することで推定できます（通常、230 nmはタンパク質から来ます。 （2）欠点：DNAとRNAを区別することは不可能です。これは、紫外線吸収の構造が核酸の基底であるため、DNAとRNAの両方にDNAとRNAが含まれている場合、測定の濃度は真の濃度よりも高くなります。 2。蛍光色素法（1）原理：標的固有の色素を使用します。これは、異なるタイプの核酸鎖に特異的に結合し、特定の波長での光源の励起下で蛍光を発することができます。その中で、信号は無料のものと比較して数十から数百倍増加する可能性があるため、背景と区別できます。 （2）操作：蛍光色素でテストするDNAサンプルを混合し、蛍光色素がDNAに結合して蛍光錯体を形成します。次に、混合物をキュービット測定器に配置し、レーザーで蛍光錯体を興奮させ、蛍光信号を放出します。キット測定機器は、蛍光信号の強度に基づいてDNA濃度を自動的に計算します。 （3）利点：高感度、簡単で迅速な操作、効率的な検出プロセス、および組み込みの分析ソフトウェアがデータの計算を簡素化し、検出が完了した直後にライブラリ濃度を提示することができます。 （4）短所：サンプルが20〜30を超えると、この検出方法はわずかに低くなり、結果は一般にマシンの最終濃度として使用されません。 3.リアルタイムの定量的PCR法（QPCR）（1）原理：蛍光検出技術とPCRテクノロジーを使用して、PCR反応システムに蛍光グループを追加し、PCRプロセス全体の変化をリアルタイムで監視して、最終的に濃度の濃度の変化を反映します。 （2）特定のプライマーは、2つのエンドジョイントの完全なライブラリのみを定量化できます。これは、シングルエンドまたは両端のジョイントでリンカーに接続していないシーケンシングライブラリからの干渉を排除し、現在、ライブラリの定量化に適しています。 （3）短所：高コスト。

3。スキル1.核酸汚染を排除して回避する：ライブラリで使用される標準の濃度は、高濃度の標準から環境への核酸汚染を引き起こす可能性があり、それによりネガティブコントロールと低濃度の標準の結果に影響します。したがって、図書館の定量化を行う研究所は、定期的に核酸を除去する必要があります。実験技術の後、環境内の核酸は紫外線処理で酸化することができます。 2。ライブラリの希釈検証：ライブラリは、2つの勾配を希釈し、互いに検証することを推奨しています。指示は、特定の実験操作中に2つの勾配濃度を10倍に設定することも可能です。 10,000回と20,000回のCT値の違いは、約0.951.05の間であり、10,000回と100,000回のCT値の差は約3.34であることに注意してください。 3.増幅効率の影響を除外する：ライブラリを2つの勾配に希釈することによって得られる濃度偏差が大きいことが計算結果が大きいことがわかった場合、それは不正確な希釈、またはライブラリの増幅効率が低く、大きなCTになります。この時点で、このライブラリは4〜5の10​​倍希釈勾配にすることができ、増幅効率はオンボードのCT値に基づいて計算できるため、増幅効率の要因が排除されます。

ライブラリの定量化は、ハイスループットシーケンスプロセスの重要なリンクであり、その重要性は自明です。定量的な方法を合理的に選択し、定量的手法を柔軟に適用することにより、科学研究者は図書館の品質情報をより正確に把握し、その後のバイオインフォマティクス分析と科学研究のための強固な基盤を築くことができます。

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